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くっつかない。

IPでしっかりと結合が見えるものを、大腸菌で別々に作ってみたら、ちっとも結合しない。片方を細胞から精製してみて、もう片方は大腸菌にしても結合するかみてもいまいち。両方とも細胞内で作られないとだめなのか?片方は、昔Kさんが研究していたタンパク質で、御大曰く、"Kはじゃじゃ馬を乗りこなせていない"、とのことだったが、ちょっと一筋縄ではいかないぞ、というのがわかってきた。アイデアが必要だ。
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順序をかえてみる

今やってる実験は、免疫沈降させたタンパク質複合体をある酵素で処理してから、タンパク質間相互作用が弱くなるということを示そうとしているのだけれど、うまくいかなそうなので、別々にタンパク質を用意してから酵素処理の有り無しが相互作用にどう影響があるかを見る、という実験を試してみることにする。

今日は奥が遅くまで仕事する日なので、17時にラボを出て大急ぎで家に向かった。ところがあと二駅というところで電車が止まった。人身事故だということだった。電車はいつ動くかわからないので駅の外に出て見たけれど、タクシーなどもまったくこない。iPhoneで見てみると自分の最寄り駅までは2.5km程度だった。そこまで走ればそこからは自転車なのでなんとかなりそうだ、と考えて走り始めた。家に電話して娘に状況説明をしておいた。結局、予定より30分遅れて家についた。さっと作れるパスタを作って夕飯にした。

鮮やかなネガティブデータ

あるモデルを証明しようとシャカリキになって毎日実験しているのだけれど、ある実験がキレイなネガティブデータだった。たいていのネガティブデータというのは、何かしら問題があって、系がうごいてないんじゃないか、とか、酵素が失活してないか、とか、反応条件がよろしくないんじゃないか、とか、まあ、結局みんな同じことを言ってるわけなんだけど、まだ仮説が死んだわけではなく単なる実験失敗の可能性を論じる余地が残っていることが多い。で、あれこれと実験を繰り返し、別角度からもネガティブの結果がでてきてようやく、あるモデルや仮説が死ぬ。そんな経過を辿った仮説が僕の実験ノートにはたくさんある。

いつも思うのだけど、実験動物の供養をする人はいるけれど、死んだ仮説の供養もすべきなんじゃないかな。今年はこんなに仮説がボツになりました。と、振り返るだけでもかなり有意義だ。ひとつのモデルを考えてから、それに白黒をつける過程で、たとえそれがネガティブでもそれなりの収穫があるだろうし。

今回の場合、ある酵素反応によってタンパク質間相互作用が影響を受けるのではないかと考えて、ある酵素反応を試験管内で再現して相互作用を見ようとしたのだけど、試験管内での再現は素晴らしい結果だったけど、相互作用には影響なし、という、半分笑って、半分泣く、という感じだった。こういうキレイなネガティブデータは、考察もしやすい。あれこれ考えて、いろんな人と議論して、結局まだ全然仮説は死んでいない、と強がっているのが、今日このごろの僕の状態。試験管内と細胞内は違うのさ、とかいう都合のいい意見にとびついたりしながら。

PEIはオススメ

先日、とある大学で招待講演をした際に教わった激安トランスフェクション試薬を試してみた。とりあえず、凄い、の一言。PEIと呼ばれる白い粉を水に溶かしてpH調整してろ過滅菌後、凍結融解を8回行った。1mlが約3円(人件費は含まず)である。

PEI: Polyethylenimine "Max"

Fugene HDとXtremeGENE HPをいままで使っていたのでHeLaで比較してみたところ、Fugene HD=PEI>XtremeGENE HPという結果になった。ものすごく安い上に、細胞にはかなり優しくて導入効率もかなりいいのでオススメです。

追記: はじめ商品名を伏せて書いていましたが、コメントを受けてそのまま載せるように変更しました。

実験しまくり

奥が子どもたちをつれて実家に帰った。お父さんが亡くなった後のいろいろがまだ残っているのと、お母さんがちょっとダウンしているようなので孫の顔でもみせて元気をだしてもらうとのこと。うちもあんたが先に死んだら悲しむんやろか~、と言っていたが、なんと返答していいのか困った。僕のほうが長生きしそうだなと思ったが、それを言ってどうする、と思い、イケメンジジイ捕まえて楽しくやってるでしょう、とだけ答えておいた。

そんなわけで休日だが朝から実験し放題だった。染色体ワークショップに申し込んだり、細々としたデスクワークもあったけど、ラボにいる時間の大部分を実験台の前で過ごせたのは久しぶりだった。

プライマーを間違えていた

ある遺伝子のフラグメントを増幅しようと思い、PCRをしていたのだけど、ちっとも増えてこない。しょうがないのでtemplateを増やしたりあれこれ条件をいじってPCRを繰り返していたら、巨大なDNAが見えてきた。なんとtemplate plasmidそのもの。マヌケなゲルをしばらく呆然と眺める。

あまりにもおかしいので、なにか決定的な勘違いをしてると思い、プライマーの配列まで確認してみたら、なんとプライマーが間違っていたという、お粗末なミス。そりゃ、増えない。

今日一日は自分のマヌケぶりを再確認するために費やされた。

光は見えてきたか?

トドメと思った実験がなかなか決まらないでいたのですが、ようやく少し希望が見えてきました。まだ、早とちりかもしれませんが…

論文の最後のところで、僕が研究しているタンパク質Aが、ある酵素Bを阻害している可能性が出てきました。タンパク質Aが酵素Bを阻害する効果自体は既に、in vitroでの結果が報告されているのですが、細胞内のどこでいつの時期に効果を発揮しているのかわかっていませんでした。タンパク質Aが酵素Bに結合できない状態をつくると、どうも酵素Bの活性が高い状態にあるような状況証拠が見えてきました。タンパク質Aはその時期まったく別の役割があるのですが、同時に酵素Bの阻害という仕事も果たしている、というふうに考えたわけです。ちょっとした衝撃のある話になるはずです。

そのことをしっかりと示すには、直接細胞抽出液の酵素活性を測定して差があることを示すのが一番です。これで決めてNatureだ、くらいの勢いで始めたのですか、これがなかなか決まりません。酵素Bの基質の状態を抗体など使って見てみると、確かに期待通りの差があるのですが、活性を測ると差がない、という不思議な状態でした。

もちろん、問題はまだわかりません。ただ、いまかなり疑っているのはキットです。というのは、キットでは基質として短いペプチドを使っているのですが、タンパク質Aが酵素Bの活性を直接制御するのではなく、基質とのアクセスを邪魔しているとしたら、ペプチドでは小さすぎるかもしれません。大きめのタンパク質を基質にしたら差が見えるかなと、期待しています。

キットなんていつもは使わないのですが、もしこれで上手く行ったらちょっと皮肉です。一ヶ月以上も足止めを食らったわけですから。

とどめがなかなか

ボスの発表もヨーロッパで上々の評判だったようで、論文を英文校正に出す段階まであと少しです。やっとたどりついた、という感じですが、とどめと思って取り組んでいた実験がいまいちパッとしません。その結果がなくても行ける、などとボスはイケイケですが…

いろいろ議論を重ねていますが、今は少し人工的すぎる系で実験しているので、生理条件にしてやりなおしてみることにしました。どうなるでしょうか。

一緒に論文だそうよというお誘いをことわっていたのですが、

しばらく前になりますが、アメリカのグループが、僕とおなじような現象をみつけたから同時に出しませんか、と持ちかけてくれていましたが、断りました。まあ、断ったというより、待てないならお先にどうぞと言ったんですが。

理由は、いくつかあって、最大の理由は彼らにとってはメリットがあるかもしれないけど、僕らにはなさそうだったということでした。ある遺伝子の機能阻害をした時の表現型についてだったんですが、彼らにとってはそれがメインなんですが、僕らのとっては話のホンの一部でしかないことでした。とはいえ、正直なところ、たとえマイナーなないようであっても先に出されるのはあまり気分のいいものではないので、悩みましたが、見せてくれたデータがいまいちだったので、これはアクセプトに時間がかかるな、と判断しました。

予想通り、というと失礼ですが、ヨーロッパに出張中のボスからメールが来て、彼らの論文はあちこちで門前払いのようです。

さてそれはさておき、今日あたりボスはヨーロッパのミーティングで僕の最新の結果を発表してるはずです。どんな反響があるか楽しみです。僕はというと先日からRI室にこもりトドメとなるべき実験をやっています。良さそうな結果がでています。うちの研究所のRI室はとても広いのですが(4部屋もある)誰も使っていません。いまどき、RIなんか使わないようですね。

活気のある学会

日本の分子生物学会(分生)と違うなと感じるのは、口演の数が少ないことです。もちろん、たくさんのセッションがあるのですが、ひとつのセッション内の口演の数が少ないように感じます。だいたいどれも20分くらいの時間が割り当てられています。分生では15分以内だったりもっと少なかったりしますよね。こちらではポスターがかなり充実している印象を受けます。ポスター会場をこんなに熱心に見て回ったのは、実は恥ずかしながら初めてです。分生では数に圧倒されて、知り合いの発表だけ見に行く、というのが僕のいつものパターンでした。。。

もうひとつ新しい発見というか、これも本当はこの分野にいるなら知っておかなくてはいけないことだと思いますが、井上信也博士という人を初めて見ました。今回は、ASCBの50周年なのですが、それを祝うために大御所がずらりと集まり、何人かのノーベル賞受賞者も来ていたようです(2008年に下村博士と一緒に受賞したRoger Tsien博士を見ました)。その大御所の中に、車いすに座った長老風のアジア人がいて、誰なんだろう?と思っていたら、井上信也博士でした。顕微鏡の世界の神のような存在です。80歳を越えているようです。

http://ja.wikipedia.org/wiki/井上信也

会頭のTim Mitchisonの記念講演にも、Shinyaが撮った歴史的な映像だ、という話が出てきました。

ポスター会場でもあちこちに出没していたようで、ポスターにボールペンで書き込みがあったので、これは何?と聞くと、Shinyaが来て、彼に説明するために書き込んだのよ、ということでした。

僕らの分野でよく論文を目にする人も、彼の弟子だったらしく、そうやってみると、僕らのまわりには彼の孫弟子がいっぱいるということみたいですね。

恥ずかしながら、知りませんでした。

解析、解析、解析、、、

膨大な実験結果を解析中です。
微妙な結果が出ているのですが、なかなか悩ましいところです。
ものすごく重要というわけではないのですが、白黒つけておきたい気持ちもあります。
白黒つけるにはそれなりの労力をかけなくてはいけませんが、
かけたところで、きれいな白黒がつくとはかぎりません。
また、仮に白黒ついたとしてもそれほど大きな結果でもありません。

ひたすら前進し続けて、余裕ができたら戻ってくることにする、
というのがありがちな判断ですが、
きっと余裕ができても戻ってきません。
うーん。

ブレークスルー、奥帰還

ここ数週間ちっともうまく行かなかった実験がなんとか本日うまくいきました。
BAC (bacterial artificial chromosome)を改変するという技術を使って、
タグ付きのタンパク質を細胞内で発現させようとしているのですが、
BAC改変の段階でずいぶんとつまずいてしまいました。
去年の今頃、別の遺伝子をいくつか改変できていたのですが、
今回トライした遺伝子ではどういうわけか失敗続き。
ドツボにはまる、というらしいですが、
はまりすぎるとよくないですね。

続きを読む»

うまく行くはずの実験が失敗!

これは、実験というより単純作業の類いなんですが、
本日行った、DNA断片をfidelityの高いtaqを用いて増幅する、
という実験(ていうか作業)は、全く何も増えてきませんでした。
taqの失活なんてことがあるんだろうか、と思い、
数日前にちゃんと増えた断片を増やしてみると、
うっすらと増える程度。
こういう結果だと、
すぐさまtaq失活といいにくいのですね(限りなく疑わしいですが)。
数日の間に、何があったんだろうと思う訳ですが、
ほかにもfidelityの高いpolymeraseはあったので、それらを試して今日は帰ります。

ほかのもっと重要な実験が、バシバシと決まっているのですが、
うちのラボの寮母的存在の技術員のかた(age 60♀)に言わせると、

こういうところでつまづいてしまうようではマダマダです、

だそうです。
肝に銘じて精進いたします。

“作業”は昼メシ前に

昨日のつづきになっちゃうんですが、実験と作業についてです。

mini prepとかタンパク定量のような実験、つまり僕が“作業”と呼んでいるような仕事って、
結構緊急性が低いことが多く、その日のほかの仕事、
より緊急性の高い仕事が優先されて、後回しになりがちです。
で、どうなるかというと、帰る間際に
あ、あれやってなかった
ということになり、大慌てでやる、というパターンが僕の場合多いです。

これはいかんよな、と常々思うのですが、
仕事には優先順位がどうしてもあるので、
後回しになってしまうのは避けられません。
で、いま試しにやっているのが、
作業は昼メシ前にやってしまう!です。

昼ご飯の前に、腹減ったなあ、と思ったら、
まず、作業をする時間がやってきた、ということにして、
今日やる予定だった作業を全部やってしまうことにしています。
これが意外にうまくいっていて、
やり忘れがなくなりました。

もちろん、すべての作業が午前中に片付くわけでなないのですが、
一日の仕事のなかに、ちょっとした時間割みたいなものを組み込むような意識で利用しています。

実験と作業について

毎日実験室でやることと言えば、もちろん実験です。
実験台の上でピペットマンやエッペンチューブをふりまわして、
ウェスタンやらPCRをやっているわけです。
ただ、実験っていうと、仮説を検証したり証明したりするものを指すものを思い浮かべるのですが、
実際には、僕がやってる"実験”の約7割強が、仮説を証明する実験のための道具作りなどです。
これって、どちらかというと、"作業”ですよね。
たとえば、プラスミド抽出やタンパク定量、細胞の継代は、実験じゃなくて作業って呼ぶべきって思うんですよね。

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Author:togran
都内某所で研究しています。そろそろ独立を考える今日この頃です。

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